| Prof. Maurizio Cutolo –MD, EULARHon, ACRMaster, Honorary Doctorate,Professor of Rheumatology Senior Consultant, Division of Rheumatology, DiMI University of Genova, Italy
In questo video esclusivo, realizzato presso i Laboratori di Reumatologia Sperimentale del Di.M.I. dell’Università degli Studi di Genova, il Professor Maurizio Cutolo e il suo team di ricerca ci guidano in un viaggio straordinario: dal prelievo ematico all’identificazione dei monociti ibridi, una popolazione cellulare innovativa che potrebbe trasformare la diagnosi, la predizione e il trattamento delle malattie del tessuto connettivo.
Il video si apre con il Professor Cutolo che illustra il principio della doppia traslazione: dal letto del paziente al laboratorio e viceversa. La scienza clinica moderna consente oggi di effettuare un semplice prelievo ematico – una biopsia liquida – e di isolare i globuli bianchi circolanti, in particolare i monociti, il cui comportamento offre indizi fondamentali sulla progressione della malattia. Il gruppo di Genova ha identificato fino a nove sottotipi di monociti ibridi: cellule transizionali che conservano i marcatori della linea progenitrice pur esibendo già biomarcatori di superficie della loro futura funzione come macrofagi tessutali. In patologie come la sclerosi sistemica, la proporzione di queste cellule ibride nel sangue periferico può fungere da indicatore diagnostico precoce, predittore della gravità della malattia e strumento di monitoraggio della risposta terapeutica.
Fase 1 – Isolamento dei monociti Dott. Elvis Hysa –Reumatologo, Dottorando di Ricerca, Divisione di Reumatologia, DiMI Università di Genova, Italia Il flusso di lavoro in laboratorio inizia nel momento in cui arriva un campione di sangue. L’obiettivo è isolare i monociti, un tipo specifico di cellula immunitaria centrale nei processi infiammatori studiati nelle malattie reumatiche immuno-mediate.
Per ottenere monociti puri da questa miscela, il team utilizza la tecnologia EasySep: i tipi cellulari indesiderati (cellule T, cellule B) vengono marcati con particelle magnetiche e rimossi. Il risultato è una popolazione di monociti purificati, pronta per gli esperimenti successivi. Fase 2 – Coltura cellulare e differenziazione Dott.ssa Rosanna Campitiello – Reumatologa, Dottoranda di Ricerca, Divisione di Reumatologia, DiMI Università di Genova, Italia Una volta isolati, i monociti seguono percorsi sperimentali diversi in base al disegno dello studio. Un primo passaggio fondamentale è il congelamento di un’aliquota per creare una biobanca, garantendo che analisi di alta qualità come la citometria a flusso e il cell sorting possano essere eseguite in un secondo momento.
Segue la fase più impegnativa: queste cellule immunitarie vengono esposte a diversi agenti farmacologici, compresi farmaci standard e nuovi composti sperimentali come molecole antifibrotiche o immunosoppressive. Dopo l’incubazione, si raccoglie il surnatante e si lisano le cellule per ottenere le proteine e il materiale genetico, pronti per l’analisi formale. Immunofluorescence Imaging | Imaging in immunofluorescenza Orlando Izzo –BS, Dottorando di Ricerca, , Divisione di Reumatologia, DiMI Università di Genova, Italia Lavorando al microscopio a fluorescenza,
Fase 3 – Analisi genica (Real-time PCR) Dott.ssa Paola Montagna –PhD, BS, Laboratorio di Reumatologia Sperimentale,,Divisione di Reumatologia, DiMI Università di Genova, Italia Una volta estratto il materiale genetico, inizia l’analisi genica. La Real-time PCR (Reazione a Catena della Polimerasi) viene utilizzata per amplificare e evidenziare specifiche sequenze di DNA. Un colorante fluorescente si intercala nel DNA, rendendo visibile il gene bersaglio. La miscela reagente – contenente primer specifici, colorante, dNTP e l’enzima DNA polimerasi – viene preparata in condizioni sterili e dispensata in una piastra multiwell tramite un dispensatore automatico. Il campione di DNA viene quindi aggiunto in ciascun pozzetto. La piastra viene inserita in un termociclatore, dove variazioni sequenziali di temperatura guidano tre passaggi critici: denaturazione del DNA, appaiamento dei primer ed estensione del DNA. Ripetuto per molti cicli, questo processo produce un’amplificazione esponenziale. La presenza del gene bersaglio è rivelata da curve di fluorescenza sottoposte ad analisi quantitativa formale.
Fase 4 – Analisi proteica (Western Blot) Dott. Stefano Soldano –PhD, BS, Laboratorio di Reumatologia Sperimentale,,Divisione di Reumatologia, DiMI Università di Genova, Italia Dopo l’isolamento proteico dalle cellule, si procede alla quantificazione mediante un saggio colorimetrico (metodo Bradford) per rilevare la quantità totale di proteine intracellulari, extracellulari e di membrana prodotte dalle cellule. L’analisi Western blot separa quindi le proteine per peso molecolare all’interno di un gel di acrilammide a gradiente, guidata da un campo elettromagnetico. Completata la separazione, le proteine vengono trasferite su una membrana di nitrocellulosa. Anticorpi specifici vengono applicati per rilevare le proteine di interesse, che sono poi quantificate mediante chemiluminescenza. Un software misura l’intensità di ciascuna banda, corrispondente alla quantità di proteina indagata in ogni campione. L’immunofluorescenza su tessuti e cellule umane completa l’analisi proteomica. L’obiettivo finale: identificare le differenze tra pazienti e soggetti sani nella produzione proteica, svelare i meccanismi coinvolti nella patogenesi e individuare potenziali bersagli per terapie future.
Fase 5 – Analisi statistica e pubblicazione Dott. Emanuele Gotelli –MD, PhD, Ricercatore Universitario, Divisione di Reumatologia, DiMI Università di Genova, Italia L’analisi statistica viene effettuata con il software GraphPad per confrontare l’espressione genica e proteica di marcatori pro-infiammatori e anti-infiammatori da macrofagi in coltura derivati dai monociti di donatori sani e pazienti. La programmazione in R viene utilizzata per generare grafici di alta qualità: istogrammi, box plot, scatter plot, grafici di regressione, heat map e visualizzazioni interattive. Segue una riunione di team per discutere criticamente i risultati, evidenziando punti di forza e limiti di ogni esperimento. Una volta analizzati e discussi approfonditamente tutti i dati, inizia la stesura degli articoli scientifici. Diverse bozze vengono revisionate prima che il manoscritto finale sia sottomesso a riviste ad alto fattore di impatto per il processo di peer review. Conclusion | Conclusione Prof. Maurizio Cutolo – Conclusione Il Professor Cutolo chiude il video con un messaggio ottimistico. Il messaggio chiave: in molti casi, le biopsie tessutali invasive possono ora essere sostituite da un semplice campione di fluido. Questo approccio apre la strada alla scoperta di nuovi biomarcatori e nuovi bersagli terapeutici. Strategie terapeutiche basate sul blocco delle cellule ibride allo stadio circolante sono all’orizzonte e rappresentano un cambio di paradigma nella gestione delle malattie del tessuto connettivo.
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Come sottolinea il Professor Cutolo, l’obiettivo finale è sviluppare anticorpi monoclonali in grado di bloccare queste cellule circolanti prima
Il sangue viene prima diluito con una soluzione salina tamponata, quindi sottoposto a separazione su gradiente di densità. Nella centrifuga, i globuli rossi più pesanti precipitano sul fondo mentre le cellule immunitarie più leggere si depositano nella fascia intermedia, formando un anello visibile di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC).
Per le cellule destinate alla coltura, il percorso in vitro inizia con l’aggiunta di fattori di crescita specifici per indurre la differenziazione dei monociti in macrofagi derivati da monociti, le “sentinelle” del sistema immunitario. Dopo un adeguato periodo di incubazione, la maturazione può essere osservata al microscopio.
| Si ringraziano i Laboratori di Ricerca del Di.M.I., Università degli Studi di Genova.
Partecipanti (in ordine di apparizione): Maurizio Cutolo, MD, EULAR Hon, ACR Master, Laurea Honoris Causa – Professore di Reumatologia, Senior Consultant, Divisione di Reumatologia, DiMI Università di Genova, Italia Elvis Hysa, MD – Reumatologo, Dottorando di Ricerca, Divisione di Reumatologia, DiMI Università di Genova, Italia Rosanna Campitiello, MD – Reumatologa, Dottoranda di Ricerca, Divisione di Reumatologia, DiMI Università di Genova, Italia Orlando Izzo, BS – Dottorando di Ricerca, Divisione di Reumatologia, DiMI Università di Genova, Italia Paola Montagna, BS, PhD – Staff, Laboratorio di Reumatologia Sperimentale, Divisione di Reumatologia, DiMI Università di Genova, Italia Stefano Soldano, BS, PhD – Staff, Laboratorio di Reumatologia Sperimentale, Divisione di Reumatologia, DiMI Università di Genova, Italia Emanuele Gotelli, MD, PhD – Reumatologo, Ricercatore Universitario, Divisione di Reumatologia, DiMI Università di Genova, Italia |